未成熟卵体外成熟技术对小鼠肾脏肾素—血管紧张素系统基因表达和甲基化修饰的影响

【摘要】目的：研究IVM小鼠肾脏RAS系统基因如Agt、Ace、RenRenAgtr-1啊、Agtr-1b、Ace2、Agtr2和微小RNAs(Micro-RNA,MiRNAs)的表达、以及Agt和Ace的甲基化状况,阐明IVM对出生小鼠血压调控相关机制的影响。材料和方法：1.利用C57BL/6J小鼠,通过单纯注射孕马血清获取未成熟卵,经体外成熟培养、ICSI辅助受精和胚胎移植等方法建立IVM小鼠模型。通过注射孕马血清和人绒毛膜促性腺激素获取成熟卵,经ICSI辅助受精和胚胎移植等方法建立体内成熟小鼠模型(CON),出生小鼠饲养至10周及1.5年时,分别处死获取两组小鼠的肾脏组织。2.通过荧光定量PCR技术,检测10周及1.5年两组小鼠肾脏组织RAS基因如Agt、Ace、Ren1、Ren2、Agtr-1a、Agtr-1b、Ace2、Agtr2和miRNAs(miRNA698,miRNA27a,miRNA155和miRNA143)的表达。3.利用焦磷酸测序技术检测两组小鼠两个时期肾脏组织Agt和Ace的各位点的甲基化情况。4.通过western-blot技术,检测两组小鼠两个时期肾脏组织AGT、ACE、ACE2和AGTR1蛋白的表达。结果：1.IVM对出生后子代肾脏组织RAS系统各基因表达的影响(1)10周,两组小鼠肾脏组织RAS系统各基因表达分析10周时,与体内成熟小鼠相比,IVM小鼠肾脏组织Agt、Ace、Renl、Ren2和Agtr-1b表达水平显著升高,Agtr-1a和Ace2表达水平显著下降,而Agtr-2的表达差异无统计学意义。同时,IVM小鼠肾脏组织miRNA-698、miRNA-27a和miRNA-155的表达较体内成熟小鼠显著性增高；但两组间的miRNA-143的表达差异无统计学意义。(2)1.5年,两组小鼠肾脏组织RAS系统各基因表达分析1.5年时,与体内成熟小鼠相比,IVM小鼠肾脏组织Agt和Ace表达水平显著升高,Ren1、Agtr-1a、Agtr-1b、Ace2和Agtr-2表达水平显著下降,而Ren2的表达差异无统计学意义。同时,IVM小鼠肾脏组织miRNA-698、miRNA-27a和miRNA-143的表达较体内成熟小鼠显著增高,miRNA-155表达显著降低。2.IVM对出生后子代肾脏Agt和Ace甲基化修饰影响依据上述Agt及Ace的长期表达差异,选取Agt的3个甲基化位点和Ace的4个甲基化位点进行焦磷酸测序。(1)10周两组小鼠肾脏组织Agt和Ace的甲基化状态分析10周时,相较于体内成熟小鼠之间,IVM小鼠肾脏组织Agt的CpG2位点甲基化率显著性降低,Ace的CpGl和CpG2位点甲基化率显著性升高。而两组小鼠肾脏组织Agt及Ace其他CpG位点甲基化状态无统计学差异。(2)1.5年两组小鼠肾脏组织Agt和Ace的甲基化状态分析1.5年,IVM小鼠肾脏组织Ace的CpGl甲基化率低于体内成熟小鼠,差异具有统计学意义。而两组小鼠肾脏组织Agt和Ace其他CpG位点的甲基化状态没有统计学差异。3.IVM对出生后子代肾脏组织AGT、ACE、ACE2和AGTR-1蛋白表达的影响相较于体内成熟组,10周IVM小鼠肾脏组织AGT蛋白表达水平降低,差异有统计学意义,但到1.5年时,IVM小鼠肾脏组织AGT蛋白表达水平增高,差异具有统计学意义。而在10w和1.5y两个时间段,两组间小鼠肾脏组织ACE2、ACE2和AGTR-1蛋白表达水平无统计学差异。结论：1.IVM过程影响出生子代小鼠肾脏组织RAS的表达。2.IVM出生子代RAS表达异常可能与其DNA甲基化水平和微小RNA表达水平相关。
【作者】潘佩佩；
【导师】金帆；
【作者基本信息】浙江大学，妇产科，2014，硕士
【关键词】未成熟卵体外培养技术；RAS；甲基化修饰；基因表达；小鼠模型；

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